Clevers groep: Organoïden uit volwassen stamcellen

Wnt‑signaalvorming in volwassen stamcellen
Bij zoogdieren is fysiologische Wnt‑signalering nauw verweven met de biologie van volwassen stamcellen en zelfvernieuwende weefsels (18,19). Wij waren de eersten die Wnt‑signaalvorming koppelden aan de biologie van volwassen stamcellen, toen we lieten zien dat mutatie van het TCF4‑gen leidt tot het verdwijnen van stamcelactiviteit in de crypten van de dunne darm (8), en dat een knock‑out van het TCF1‑gen het stamcelcompartiment van de thymus sterk reduceert (2). Het door Tcf4 aangedreven target genprogramma in colorectale kankercellen is de maligne tegenhanger van een fysiologisch genprogramma in zelfvernieuwende crypten (13,14).

Biologie van Lgr5‑stamcellen
Het Wnt‑target gen dat codeert voor de transcriptiefactor Achaete scute‑like 2 (Ascl2) reguleert de stamceltoestand in de darm (26). Lgr5‑cryptstamcellen gedragen zich op onverwachte wijze: in tegenstelling tot de gangbare opvatting delen zij voortdurend en symmetrisch. Het aantal stamcellen blijft constant omdat stamcellen ‘neutraal’ met elkaar concurreren om ruimte in de niche (30). Dit fenomeen is bevestigd door in‑vivo‑beeldvorming (44). Dochters van de stamcellen van de dunne darm, de Paneth‑cellen, dienen als nichecellen in de crypt door Wnt‑, Notch‑ en EGF‑signalen te produceren (33). In een zeer recente studie beschrijven we hoe intestinale epitheelcellen sterven aan het einde van hun levensduur van een week, aan de toppen van de villi (80).

Lgr5 is de R‑spondin‑receptor
Lgr5 medieert de signalering van de Wnt‑agonistische R‑spondins (31), wat de unieke afhankelijkheid verklaart van Lgr5‑stamcellen van gesecreteerde R‑spondins in vivo en in vitro. Twee andere Wnt‑doelgenen, RNF43 en ZNRF3, coderen voor stamcelspecifieke E3‑ligasen die Wnt‑receptoren down-reguleren in een negatieve feedback loop (35). Onafhankelijk werk van het laboratorium van Feng Cong heeft aangetoond dat R‑spondin, gebonden aan Lgr5, RNF43/ZNRF3 bindt en inactiveert.

Langdurige klonale kweek van organoïden uit Lgr5‑stamcellen. Modellering van infectieuze, erfelijke ziekten en kanker in organoïden (review in 51).
Wnt‑signalering werkt nauw samen met de BMP‑ en Notch‑routes om proliferatie aan te drijven en differentiatie te remmen in intestinale crypten en adenomen (17,20). Op basis van deze gecombineerde inzichten hebben we Lgr5/R‑spondin‑gebaseerde kweeksystemen ontwikkeld die de uitgroei mogelijk maken van een enkele muizen‑ of humane Lgr5‑stamcel tot oneindig uitbreidende organoïden. Enkele voorbeelden zijn mini‑darmen (27,32), mini‑magen (28), dikke‑darmkankerorganoïden (32,47), leverorganoïden (39,46,55), prostaatorganoïden (45), borstkankerorganoïden (53), eierstokkankerorganoïden (59), alvleesklierkankerorganoïden (48) en zelfs orgaanoïden van slangenvenomklieren (61). Deze epitheliale orgaankweekculturen zijn genetisch en fenotypisch onverwacht stabiel, waardoor transplantatie mogelijk is van de gekweekte offsping van een enkele stamcel. En ziektes kunnen gemodelleerd worden door organoïden direct te kweken uit ziek patiëntweefsel (32,47,53). De directe klonering van meerdere individuele cellen uit primaire tumoren maakt moleculaire en functionele analyse van tumorheterogeniteit met ongekende resolutie mogelijk (54).
Organoïden lenen zich goed voor CRISPR‑gemedieerde genomemodificatie om bijvoorbeeld maligne transformatie te modelleren (49) evenals mutagenese bij foutieve DNA‑reparatie (52), of om snel knock‑in‑allelen te creëren van genen van belang (62,66). Humane rectumorganoïden modelleren de erfelijke ziekte Cystic Fibrosis (CF) en worden nu routinematig gebruikt om de medicijnrespons bij CF‑patiënten te voorspellen. In 2013 hebben wij het eerste proof‑of‑concept geleverd voor CRISPR‑gemedieerde reparatie van een erfelijke mutatie in patiëntstamcellen (43,64). Humane organoïden modelleren ook infectieziekten, zoals aangetoond onder meer voor Cryptosporidium (55), een mutagene E. coli‑stam (63) en voor SARS‑CoV‑2 (65).

Karakterisering van zeldzame epitheliale celtypen met behulp van (humane) intestinale organoïden.
Humane organoïden kunnen worden gekweekt onder omstandigheden die zijn ontworpen om zeldzame epitheliale celtypen te genereren.
Entero‑endocriene cellen (EEC’s): De transcriptionele hiërarchie van de zes EEC‑lijnages, inclusief de incretine GLP1‑producerende L‑cellen, werd in muis en mens in kaart gebracht (58,66). Met behulp van een unbiased transcription‑factor CRISPR‑screen werd ZNF800 geïdentificeerd als een masterrepressor van EEC‑differentiatie (72), terwijl single‑cell mRNA‑sequencing van humane orgaan‑EEC’s, gevolgd door gerichte CRISPR‑mutatie en farmacologische activatie van hormoonsecretie, de rol van individuele humane EEC‑sensoren in hormoonsecretie heeft verduidelijkt. Deze receptoren vormen potentiële farmacologische aangrijpingspunten om eetlust, darmmotiliteit, insulinegevoeligheid en mucosale immuniteit te beïnvloeden (76).
Tuftcellen: Een door Il4/Il13 aangedreven orgaankweekprotocol maakt de productie mogelijk van grote aantallen tuftcellen, wat is gebruikt om aan te tonen dat deze cellen fungeren als regeneratieve (reserve‑)stamcellen in de menselijke darm (75).
BEST4+‑cellen: Deze cellen, uniek voor de mens, waren eerder alleen bekend uit sc‑mRNA‑sequencingdatasets. Een specifiek orgaan‑kweekprotocol maakte het mogelijk deze cellen in grote aantallen te genereren. We hebben aangetoond dat BEST4+‑cellen worden geïnduceerd door γ‑interferon, de water‑ en elektrolytenbalans over het darmepitheel reguleren en verantwoordelijk zijn voor bacterieel geïnduceerde diarree (79).

M‑cellen: Naast het faciliteren van luminale antigeentransport naar immuuncellen in de Peyerse platen, laten we zien dat humane M‑cellen ook direct antigenen (bijv. gluten) presenteren via hun klasse‑II‑major‑histocompatibility‑complex (MHC‑II) (81).

Samenvattend winnen uit stamcellen afgeleide organoïden (eerst beschreven door Sasai voor pluripotente stamcellen en door ons voor volwassen (weefsel-) stamcellen) snel terrein als onderzoekstool in een breed scala aan wetenschappelijke disciplines, waaronder fundamentele ontwikkelings‑ en celbiologie, infectiologie, toxicologie en onderzoek naar erfelijke ziekten en kanker.

Key Publications

Selected papers (out of ~900 peer-reviewed papers with ~223,000 citations in Scopus;
h-index 223) 

1. van de Wetering, M., Oosterwegel, M., Dooijes, D. and Clevers, H., Identification and cloning of TCF-1, a T cell-specific transcription factor containing a sequence-specific HMG box. EMBO J. 10:123-132 (1991)
2. Verbeek, J.S., Ison, D., Hofhuis, F., Robanus-Maandag, E., te Riele, H., van de Wetering, M., Oosterwegel, M., Wilson, A., MacDonald, H.R. and Clevers, H. An HMG box containing T-cell factor required for thymocyte differentiation. Nature 374:70-74 (1995)
3. Schilham, M., Oosterwegel, M., Moerer, P., Jing, Y., de Boer, P., van de Wetering, M., Verbeek, S., Lamers, W., Kruisbeek, A., Cumano, A. and Clevers, H. Sox-4 gene is required for cardiac outflow tract formation and pro-B lymphocyte expansion. Nature 380:711-714 (1996)
4. Molenaar, M., van de Wetering, M., Oosterwegel, M., Peterson-Maduro, J., Godsave, S., Korinek, V., Roose, J., Destrée, O. and Clevers, H. Xtcf-3 Transcription factor mediates beta-catenin-induced axis formation in xenopus embryos. Cell 86:391-399 (1996)
5. Korinek, V, Barker, N., Morin, P.J., van Wichen, D., de Weger, R., Kinzler, K.W., Vogelstein, B. and Clevers, H. Constitutive Transcriptional Activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC-/- Colon Carcinoma. Science 275:1784-1787 (1997)
6. Morin, P.J., Sparks, A., Korinek, V., Barker, N., Clevers, H., Vogelstein, B. and Kinzler, K., Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC. Science 275:1787-1790 (1997)
7. van de Wetering, M., Cavallo, R., Dooijes, D., van Beest, M., van Es, J., Loureiro, J., Ypma, A., Hursh, D., Jones, T., Bejsovec, A., Peifer, M., Mortin, M. and Clevers, H. Armadillo co-activates transcription driven by the product of the Drosophila segment polarity gene dTCF. Cell 88:789-799 (1997)
8. Korinek, V., Barker, N., Moerer, P., van Donselaar, E., Huls, G., Peters, P.J. and Clevers, H. Depletion of epithelial stem cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf 4. Nat Genet 19:379-383 (1998)
9. Roose, J., Molenaar, M., Peterson, J., Hurenkamp, J., Brantjes, H., Moerer, P., van de Wetering, M., Destree, O. and Clevers, H. The Xenopus Wnt effector XTcf-3 interacts with Groucho-related transcriptional repressors. Nature 395:608-612 (1998)
10. Roose, J., Huls, G., van Beest, M., Moerer, P., van der Horn, K., Goldschmeding, R., Logtenberg, T. and Clevers, H. Synergie between tumor suppressor APC and the beta-catenin/Tcf4 target gene Tcf1. Science 285:1923-1926 (1999)
11. Korswagen, R., Herman, M. and Clevers, H. Separate beta-catenins mediate Wnt signaling and cadherin adhesion in C. elegans. Nature 406:527-532 (2000)
12. Bienz, M. and Clevers, H. Linking colorectal cancer to Wnt signaling. Cell 103:311-320 (2000)
13. van de Wetering, M., Sancho, E., Verweij, C., de Lau, W., Oving, I., Hurlstone, A., van der Horn, K., Batlle, E., Coudreuse, D., Haramis, A-P., Tjon-Pon-Fong, M., Moerer, P., van den Born, M., Soete, G., Pals, S., Eilers, M., Medema, R. and Clevers, H. The beta catenin/TCF4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell 111:241-250 (2002)
14. Batlle, E., Henderson, J.T., Beghtel, H., van den Born, M., Sancho, E., Huls, G., Meeldijk, J., Robertson, J., van de Wetering, M., Pawson, T. and Clevers, H. Beta- catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB. Cell 111:251-263 (2002)
15. Hurlstone, A.F., Haramis, A.P., Wienholds, E., Begthel, H., Korving, J., van Eeden, F., Cuppen, E., Zivkovic, D., Plasterk, R.H. and Clevers, H. The Wnt/beta-catenin pathway regulates cardiac valve formation. Nature 425:633-637 (2003)
16. Baas, A.F., Kuipers, J., van der Wel, N.N., Batlle, E., Koerten, H.K., Peters, P.J. and Clevers, H. Complete polarization of single intestinal epithelial cells upon activation of LKB1 by STRAD. Cell 116:457-466 (2004)
17. Haramis, A.P., Begthel, H., van den Born, M., van Es, J., Jonkheer, S., Offerhaus, G.J. and Clevers, H. De novo crypt formation and Juvenile Polyposis upon BMP inhibition. Science 303:1684-1686 (2004)
18. Radtke, F. and Clevers, H. Self-renewal and cancer of the gut: Two sides of a coin. Review Science 307:1904-1909 (2005)
19. Reya, T. and Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature 434:843-850 (2005)
20. van Es, J.H., Van Gijn, M.E., Riccio, O., van den Born, M., Vooijs, M., Begthel, H., Cozijnsen, M., Robine, S., Winton, D.J., Radtke, F. and Clevers H. Notch pathway/γ-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and neoplasia into Goblet cells. Nature 435:959-963 (2005)
21. Batlle, E., Bacani, J., Begthel, H., Jonkheer, S., Gregorieff, A., van de Born, M., Malats, N., Sancho, E., Boon, E., Pawson, T., Gallinger, S., Pals, S. and Clevers, H. EphB activity suppresses colorectal cancer progression. Nature 435:1126-1130 (2005)
22. Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling in development and disease, Review Cell 127:469-480 (2006)
23. Barker, N., Van Es, J.H., Kuipers, J., Kujala, P., Van den Born, M., Cozijnsen, M., Haegebarth, A., Korving, J., Begthel, H., Peters, P.J. and Clevers, H. Identification of stem cells in small intestine and colon by the marker gene LGR5. Nature 449:1003-1007 (2007)
24. Jaks, V., Barker, N, Kasper, M., van Es, J.H., Snippert, H.J., Clevers, H., Toftgård, R. Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells. Nat Genet. 40:1291-1299 (2008)
25. Barker, N., Ridgway, R.A., van Es, J.H., van de Wetering, M., Begthel, H., van den Born, M., Danenberg, E., Clarke, A.R., Sansom, O.J. and Clevers, H. Crypt Stem Cells as the Cells-of-Origin of Intestinal Cancer. Nature 457:608-611 (2009)
26. van der Flier, L.G., van Gijn, M.E., Hatzis, P., Kujala, P., Haegebarth, A., Stange, D.E., Begthel, H., van den Born, M., Guryev, V., Oving, I., van Es, J.H., Barker, N., Peters, P.J., van de Wetering, M. and Clevers, H. Transcription Factor Achaete Scute-Like 2 Controls Intestinal Stem Cell Fate. Cell 136:903-912 (2009)
27. Sato, T., Vries, R., Snippert, H., van de Wetering, M., Barker, N., Stange, D., van Es, J., Abo, A., Kujala, P., Peters, P. and Clevers, H. Single lgr5 gut stem cells build crypt-villus structures in vitro without a stromal niche. Nature 459:262-265 (2009)
28. Barker, N., Huch, M., Kujala, P., van de Wetering, M., Snippert, H.J., van Es, J.H., Sato, T., Stange, D.E., Begthel, H., van den Born, M., Danenberg, E., van den Brink, S., Korving, J., Abo, A., Peters, P.J., Wright, N., Poulsom, R. and Clevers, H. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell 6:25-36 (2010)
29. Snippert, H.J., Haegebarth, A., Kasper, M., Jaks, V., van Es, J.H., Barker, N., van de Wetering, M., van den Born, M., Begthel, H., Vries, R.G., Stange, D.E., Toftgård, R. and Clevers H. Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin. Science 327:1385-1389 (2010)
30. Snippert, J., van der Flier, L.G., Sato, T., van Es, J.H., van den Born, M., Kroon-Veenboer, C., Barker, N., Klein, A.M., van Rheenen, J. Benjamin D. Simons, B.D. and Clevers, H. Intestinal Crypt Homeostasis results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells. Cell 143:134-44 (2010)
31. de Lau, W., Barker, N., Low, T.Y., Koo, B.K., Li, V.S., Teunissen, H., Kujala, P., Haegebarth, A., Peters, P.J., van de Wetering, M., Stange, D.E., van Es, J., Guardavaccaro, D., Schasfoort, R.B., Mohri, Y., Nishimori, K., Mohammed,S., Heck, A.J. and Clevers, H. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature 476:293-297 (2011)
32. Sato T., Stange, D.E., Ferrante, M., Vries R.G., Van Es, J.H., van den Brink, S., van Houdt, W.J., Pronk, A, van Gorp, J., Siersema, P.D. and Clevers, H. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology 141: 1762-1772 (2011)
33. Sato, T., van Es, J.H., Snippert, H.J., Stange, D.E., Vries, R.G., van den Born, M., Barker, N., Shroyer, N.F., van de Wetering, M. and Clevers, H. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature 469:415-418 (2011)
34. Li, V.S., Ng, S.S., Boersema, P.J., Low, T.Y., Karthaus, W.R., Gerlach, J.P., Mohammed, S., Heck, A.J., Maurice, M.M., Mahmoudi, T. and Clevers, H. Wnt signaling inhibits proteasomal β-catenin degradation within a compositionally intact Axin1 complex. Cell 149:1245-1256 (2012)
35. Koo, B-K., Spit, M. Jordens, I., Low, T.Y., Stange, D.E., van de Wetering, M., van Es, J.H., Mohammed, S., Heck, A.J.R., Maurice, M.M. and Clevers, H. Tumour suppressor RNF43 is a stem cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors. Nature 488:665-669 (2012)
36. Schepers, A.G., Snippert, H.J., Stange, D.E., van den Born, M., van Es, J.H., van de Wetering, M. and Clevers, H. Lineage Tracing Reveals Lgr5+ Stem Cell Activity in Mouse Intestinal Adenomas. Science 337:730-735 (2012)
37. van Es, J.H., Sato, T., van de Wetering, M., Lyubimova, A., Yee Nee, A.N., Gregorieff, A., Sasaki, N., Zeinstra, L., van den Born, M., Korving, J., Martens, A.C., Barker, N., van Oudenaarden, A. and Clevers, H. Dll1(+) secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nat Cell Biol. 14:1099-1104 (2012)
38. Boj, S,F., van Es, J.H., Huch. M., Li, V.S., Jose, A., Hatzis, P., Mokry, M., Haegebarth, A., van den Born, M., Chambon, P., Voshol, P., Dor, Y., Cuppenm E., Fillat, C. and Clevers, H. Diabetes risk gene and Wnt effector Tcf7l2/TCF4 controls hepatic response to perinatal and adult metabolic demand. Cell 151:1595-1607 (2012)
39. Huch, M., Dorrell, C., Boj, S.F., van Es, J.H., van de Wetering, M., Li, V.S.W., Hamer, K., Sasaki, N., Finegold, M.J., Haft, A., Grompe, M. and Clevers, H. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature 494:247-250 (2013)
40. Sato, T. and Clevers, H. Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications. Review Science 340:1190-1194 (2013)
41. Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell 154:274-284 (2013)
42. Stange, D.E., Koo, B.K., Huch, M., Sibbel, G., Basak, O., Lyubimova, A., Kujalla, P., Bartfeld, S., Koster, J., Geahlen, J.H., Peters, P.J., van Es, J., van de Wetering, M., Mills, J.C. and Clevers, H. Differentiated Troy+ chief cells act as ‘reserve’ stem cells to generate all lineages of the stomach epithelium. Cell 155:357-368 (2013)
43. Schwank, G., Koo, B.K., Sasselli, V., Dekkers, J.F., Heo, I., Demircan, T., Sasaki, N., Boymans, S., Cuppen, E., van der Ent, C.K., Nieuwenhuis, E.E., Beekman, J.M. and Clevers, H. Functional Repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in Intestinal Stem Cell Organoids of Cystic Fibrosis Patients. Cell Stem Cell 13:653-658 (2013)
44. Ritsma, L., Ellenbroek, S.I., Zomer, A., Snippert, H.J., de Sauvage, F.J., Simons, B.D., Clevers, H. and van Rheenen, J. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature 507:362-365 (2014)
45. Karthaus, W.R., Iaquinta, P.J., Drost, J., Gracanin, A., van Boxtel, R., Wongvipat, J., Dowling, C.M., Gao, D., Begthel, H., Sachs, N., Vries, R.G., Cuppen, E., Chen, Y., Sawyers, C.L. and Clevers, H. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell 159:163-175 (2014)
46. Huch, M., Gehart, H., van Boxtel, R., Hamer, K., Blokzijl, F., Verstegen, M., Ellis, E., van Wenum, M., Fuchs, S., de Ligt, J., van de Wetering, M., Sasaki, N., Boers, S., Kemperman, H., de Jonge, J. IJzermans, J., Niewenhuis, E., Hoekstra, R., Strom, S., Vries, R., van der Laan, L., Cuppen, E. and Clevers, H. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell 160:299-312 (2015)
47. van de Wetering, M., Francies, H.E., Francis, J.M., Bounova, G., Lorio, F., Pronk, A., van Houdt, W., van Gorp, J., Taylor-Weiner, A., Kester, L., McLaren-Douglas, A., Blokker, J., Jaksani, S., Bartfeld, S., Volckman, R., van Sluis, P., Li, V.S.W., Seepo, S., Sekhar Pedamallu, C., Cibulskis, C., Carter, S.L., McKenna, A., Lawrence, M.S., Lichtenstein, L., Stewart, C., Koster, J., Versteeg, R., van Oudenaarden, A., Saez-Rodriguez, J., Vries, R.G.J., Getz, G., Wessels, L., Stratton, M.R., McDermott, U., Meyerson, M., Garnett, M.J and Clevers, H. Prospective derivation of a ‘Living Organoid Biobank’ of colorectal cancer patients. Cell 161:933-945 (2015)
48. Boj, S.F., Hwang, C.I., Baker, L.A., Chio, I.I., Engle, D.D., Corbo, V., Jager, M., Ponz-Sarvise, M., Tiriac, H., Spector, M.S., Gracanin, A., Oni, T., Yu, K.H., van Boxtel, R., Huch, M., Rivera, K.D., Wilson, J.P., Feigin, M.E., Öhlund, D., Handly-Santana, A., Ardito-Abraham, C.M., Ludwig, M., Elyada, E., Alagesan, B., Biffi, G., Yordanov, G.N., Delcuze, B., Creighton, B., Wright, K., Park, Y., Morsink, F.H., Molenaar, I.Q., Borel Rinkes, I.H., Cuppen, E., Hao, Y., Jin, Y., Nijman, I.J., Iacobuzio-Donahue, C., Leach, S.D., Pappin, D.J., Hammell, M., Klimstra, D.S., Basturk, O., Hruban RH, Offerhaus GJ, Vries RG, Clevers H, Tuveson DA. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell 160: 324-338 (2015)
49. Drost, J., van Jaarsveld, R.H., Ponsioen, B., Zimberlin, C., van Boxtel, R., Buijs, A., Sachs, N., Overmeer, R.M., Offerhaus, G.J., Begthel, H. Korving, J., van de Wetering, M., Schwank, G. Logtenberg, M., Cuppen, E., Snippert, H.J., Medema, J.P., Kops, G.J.P.L. and Clevers, H. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature 521:43-47 (2015)
50. Farin, H.F., Jordens, I., Mosa, M.H., Basak, O., Korving, J., Tauriello, D.V.F., de Punder, K., Angers, S., Peters, P.J. Maurice, M.M. and Clevers, H. Visualization of the short-range Wnt gradient in the intestinal stem cell niche. Nature 530:340-343 (2016)
51. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell 165:1586-1597 (2016)
52. Drost, J., van Boxtel, R., Blokzijl, F., Mizutani, T., Sasaki, N., Sasselli, V., de Ligt, J., Behjati, S., Grolleman, J.E., van Wezel, T., Nik-Zainal, S., Kuiper, R.P., Cuppen, E. and Clevers, H. Use of CRISPR-modified human stem cell organoids to study the origin of mutational signatures in cancer. Science 358:234-238 (2017)
53. Sachs, N., de Ligt, J., Kopper, , Gogola E., Bounova G., Weeber, F., Balgobind, A.V., Wind, K., Gracanin, A., Begthel, H., Korving, J., van Boxtel, R., Duarte, A.A., Lelieveld, D., van Hoeck, A., Ernst, R.F., Blokzijl, F., Nijman, I.J., Hoogstraat, M., van de Ven, M., Egan, D.A., Zinzalla, V., Moll, J., Boj, S.F., Voest, E.E., Wessels, L., van Diest, P.J., Rottenberg, S., Vries, R.G.J., Cuppen, E. and Clevers, H. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell 172:373-386 (2018)
54. Roerink, S., Sasaki, N., Lee-Six, H., Young, M., Alexandrov, L., Behjati, S., Mitchell, T., Grossmann, S., Lightfoot, H., Egan, D., Pronk, A., Smakman, N., van Gorp, J., Anderson, E., Gamble, S., Alder, C., van de Wetering, M., Campbell, P., Stratton, M. and Clevers, H. Intra-tumour diversification in colorectal cancer at the single-cell level. Nature 556:457-462 (2018)
55. Heo, I., Dutta,, Schaefer, D.A., Lakobachvili, N., Artegiani, B., Sachs, N., Boonekamp, K.E., Bowden, G., Hendrickx, A.P.A., Willems, R.J.L., Peters, P.J., Riggs, M.W., O’Connor, R. and Clevers, H. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nat Microbiol. 3:814-823 (2018)
56. Hu, H., Gehart, H., Artegiani, B., Löpez-Iglesias, C., Dekkers, F., Basak, O., van Es, J., Chuva de Sousa Lopes, S.M., Begthel, H., Korving, J., van den Born, M., Zou, C., Quirk, C., Chiriboga, L., Rice, C.M., Ma, S., Rios, A., Peters, P.J., de Jong, Y.P. and Clevers, Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell 175:1591-1606 (2018)
57. Tuveson, D. and Clevers, Cancer modeling meets human organoid technology. Science 364:952-955 (2019)
58. Gehart, H., van Es, J.H., Hamer, K., Beumer, J., Kretzschmar, K., Dekkers, J.F., Rios, A. and Clevers, Identification of Enteroendocrine Regulators by Real-Time Single-Cell Differentiation Mapping. Cell 176:1158-1173 (2019)
59. Kopper , O., de Witte, C.J., Lõhmussaar, K., Valle-Inclan, J.E., Hami, N., Kester, L., Balgobind, A.V., Korving, J., Proost, N., Begthel, H., van Wijk, L.M., Revilla, S.A., Theeuwsen, R., van de Ven, M., van Roosmalen, M.J., Ponsioen, B., Ho, V.W.H., Neel, B.G., Bosse, T., Gaarenstroom, K.N., Vrieling, H., Vreeswijk, M.P.G., van Diest, P.J., Witteveen, P.O., Jonges, T., Bos, J.L., van Oudenaarden, A., Zweemer, R.P., Snippert, H.J.G., Kloosterman, W.P. and Clevers, An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25:838-849 (2019)
60. Tuveson, D. and Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science 364:952-955 (2019)
61. Post, Y., Puschhof, J., Beumer, J., Kerkkamp, H.M., de Bakker, M.A.G., Slagboom, J., de Barbanson, B., Wevers, N.R., Spijkers, X.M., Olivier, T., Kazandjian, T.D., Ainsworth, S., Iglesias, C.L., van de Wetering, W.J., Heinz, M.C., van Ineveld, R.L., van Kleef, R.G.D.M., Begthel, H., Korving, J., Bar-Ephraim, Y.E., Getreuer, W., Rios, A.C., Westerink, R.H.S., Snippert, H.J.G., van Oudenaarden, A., Peters, P.J., Vonk, F.J., Kool, J., Richardson, M.K., Casewell, N.R. and Clevers, Snake Venom Gland Organoids. Cell 180:233-247 (2020)
62. Artegiani, B., Hendriks, D., Beumer, J., Kok, R., Zheng, X., Joore, I., Chuva de Sousa Lopes, S., van Zon, J., Tans, S. and Clevers, H. Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR-Cas9 precision genome editing. Nat Cell Biol. 22:321-331 (2020)
63. Pleguezuelos-Manzano, C., Puschhof, J., Huber, A.R., van Hoeck, A., Wood, H.M., Nomburg, J., Gurjao, C., Manders, F., Dalmasso, G., Stege, P.B., Paganelli, F.L., Geurts, M.H., Beumer, J., Mizutani, T., van der Linden, R., van Elst, S.; Genomics England Research Consortium, Top J., Willems, R.J.L., Giannakis, M., Bonnet, R., Quirke, P., Meyerson, M., Cuppen, E., van Boxtel, R. and Clevers, H. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks₊ coli. Nature 580:269-273 (2020)
64. Geurts, M.H., de Poel, E., Amatngalim, G.D., Oka, R., Meijers, F.M., Kruisselbrink, E., van Mourik, P., Berkers, G., de Winter-de Groot, K.M., Michel, S., Muilwijk, D., Aalbers, B.L., Mullenders, J., Boj, S.F., Suen, S.W.F., Brunsveld, J.E., Janssens, H.M., Mall, M.A., Graeber, S.Y., van Boxtel, R., van der Ent, C.K., Beekman, J.M. and Clevers, H. CRISPR-Based Adenine Editors Correct Nonsense Mutations in a Cystic Fibrosis Organoid Biobank. Cell Stem Cell 26:503-510 (2020)
65. Lamers, M.M., Beumer, J., van der Vaart, J., Knoops, K., Puschhof, J., Breugem, T.I., Ravelli, R.B.G., van Schayck, J.P., Mykytyn, A.Z., Duimel, H.Q., van Donselaar, E., Riesebosch, S., Kuijpers, H.J.H., Schipper, D., van de Wetering, W.J., de Graaf, M., Koopmans, M., Cuppen, E., Peters, P.J., Haagmans, B.L. and Clevers, H. SARS-CoV-2 productively Infects Human Gut Enterocytes. Science 369:50-54 (2020)
66. Beumer, J., Puschhof, J., Bauzá-Martinez, J., Martínez-Silgado, A., Elmentaite, R., James, K.R., Ross, A., Hendriks, D., Artegiani, B., Busslinger, G., Ponsioen, B., Andersson-Rolf, A., Saftien, A., Boot, C., Kretzschmar, K., Geurts, M.H., Bar-Ephraim, Y.E., Pleguezuelos Manzano, C., Post, Y., Begthel, H., van der Linden, F., Lopez-Iglesias, C., van de Wetering, W.J., van der Linden, R., Peters, P.J., Heck, A.J.R., Goedhart, J., Snippert, H., Zilbauer, M., Teichmann, S.A., Wu, W. and Clevers, H. High Resolution mRNA and Secretome Atlas of Human Enteroendocrine Cells. Cell 181:1291-1306 (2020)
67. Lohmussaar K., Oka R., Espejo Valle-Inclan J., Veersema S., […] van Boxtel R., Clevers H. Patient-derived organoids model cervical tissue dynamics and viral oncogenesis in cervical cancer.
    Cell Stem Cell 28:1-17 (2021)
68. Bannier-Hélaouët M., Post Y., Korving J. […] Imhoff S., Clevers H. Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing. Cell Stem Cell 28:1-12 (2021)
69. He GW, Lin L, DeMartino J, Zheng X, […] Holstege F, Clevers H. Optimized human intestinal organoid model reveals interleukin-22-dependency of paneth cell formation. Cell Stem Cell 29:1333-1345 (2022)
70. Hendriks D, Brouwers JF, […] Artegiani B, Clevers H. Engineered human hepatocyte organoids enable CRISPR-based target discovery and drug screening for steatosis.
    Biotechnology 41(11): 1567-1581 (2023)
71. Dayton T, Alcala N, Moonen L, Den Hartigh L […] Fernández-Cuesta L, Clevers H. Druggable Growth Dependencies and Tumor Evolution Analysis in Patient-Derived Organoids of Neuroendocrine Neoplasms from Multiple Body Sites. Cancer Cell, 41(12):2083-2099.e9. (2023).
72. Lin L, DeMartino J, Wang D, Van Son JF,  […] Van Es J, Clevers, H. Unbiased transcription factor CRISPR screen identifies ZNF800 as master repressor of enteroendocrine differentiation. Science, 27, 382: 451-458 (2023)
73. Hendriks D, Pagliaro A, Andreatta F, Ma Z, […] Clevers H*, Artegiani B* (*: equal contribution). Human fetal brain self-organizes into long-term expanding organoids. Cell 178: 712-732 (2024)
74. Bannier-Hélaouët M, Korving J, Ma Z, Begthel H, […] Wu W, Clevers H.  Human conjunctiva organoids to study ocular surface homeostasis and diseases. Cell Stem Cell 31:227-243 (2024).
75. Huang L, Bernink JH, Giladi A, Krueger D […] Peters PJ, Clevers HTuft cells act as regenerative stem cells in the human intestine. Nature 634(8035):929-935 (2024)
76. Beumer, J, Geurts, MH, Geurts, V, Andersson-Rolf, A, Akkerman, A, […] Van Es, J, Clevers, H. Description and functional validation of human enteroendocrine cell sensors, Science 18;386(6719):341-348 (2024)
77. Mizutani T, Boretto M, Lim S, Drost J, […] van Boxtel R, Clevers H. Recapitulating the adenoma-carcinoma sequence by selection of four spontaneous oncogenic mutations in mismatch-repair-deficient human colon organoids, Nature Cancer (2024)
78. Andersson-Rolf, A, Groot, K, Korving, J, Begthel, H, […] van Es, J, Clevers, H. Long-term in vitro expansion of a human fetal pancreas stem cell that generates all three pancreatic cell lineages,
    Cell 187, 7394–7413 (2024)
79. Wang D, Spoelstra W, Lin L, Akkerman N, […] van Es J, Clevers H. Interferon-responsive intestinal BEST4/CA7+ cells are targets of bacterial diarrheal toxins. Cell Stem Cell 32, 1-15 (2025)
80. Krueger D, Spoelstra WK, Mastebroek JW, Rutger Kok, NU, […] Tans, SJ, Clevers, H. Epithelial tension controls intestinal cell extrusion. Science 389(6764): eadr8753 (2025).
81. Wang, D, Lim, S., … and Clevers, H. Human gut M cells resemble dendritic cells and present gluten antigen. Nature 650, pages251–260 (2026)
82. Clevers, H. Shifting Paradigms in Tissue Stem Cell Biology: Insights from the Intestine (review). Cell 189: 706-724 (2026).