den Hertog: Tyrosine fosfatases in ontwikkeling

Zebravis embryo’s als model systeem

Wij gebruiken zebravis embryo’s om PTP’s te bestuderen tijdens de embryonale ontwikkeling en in ziektes en om te zoeken naar biologisch actieve stoffen uit schimmels. Zebravis embryo’s zijn een excellent model system om de ontwikkeling van gewervelde dieren te bestuderen. Een paar zebravissen produceert 100-200 embryo’s per keer en dat een of twee keer per week. Embryo’s worden eenvoudig verzameld omdat zij in het water worden gelegd en bevrucht. De embryo’s zijn transparant, wat helpt bij de analyse van de ontwikkeling van interne organen. Veel transgene lijnen zijn beschikbaar die fluorescente eiwitten produceren in specifieke cellen en weefsels. Bovendien zijn er veel knock-outs beschikbaar die bepaalde gen-functies missen. CRISPR/Cas9 technologie is ontwikkeld die het mogelijk maakt om efficiënt gen knock-outs en knock-ins te maken. Kortom, zebravis embryo’s vormen een ideaal modelsysteem om de vroege embryonale ontwikkeling van gewervelde dieren te bestuderen.

RASopathiën

De helft van alle gevallen van Noonan syndroom (NS) wordt veroorzaakt door een mutatie in de PTP SHP2. NS is een van de meest voorkomende RASopathiën; 1 op 2.000 pasgeborenen is aangedaan. RASopathiën vormen een groep van syndromen bij de mens die gemeen hebben dat het RAS/MAPK signaaltransductie pad is aangedaan. Deze syndromen hebben overlappende symptomen, zoals klein postuur, craniofaciale defecten en hartafwijkingen. Deze syndromen worden veroorzaakt door dominant overervende mutaties in factoren van het RAS/MAPK signaaltransductiepad. De NS mutaties in SHP2 veroorzaken de opening van een auto-inhibitoire conformatie van Shp2, wat leidt tot activatie van de catalytische activiteit. Wij gebruiken zebravis embryo’s om de celbiologische en ontwikkelingsbiologische gevolgen van NS te bestuderen. In eerste instantie hebben wij Shp2 varianten met mutaties die in NS patiënten waren gevonden tot expressie gebracht met behulp van microinjectie van synthetisch mRNA dat codeert voor varianten van NS geassocieerde genen. De fenotypes zijn vergelijkbaar met de symptomen van NS patiënten, zoals hartafwijkingen, craniofaciale defecten en geringe lengte. Inmiddels hebben wij zebravis knock-in lijnen gegenereerd met mutaties in NS-geassocieerde genen, waaronder Shp2, Sos1 and Sos2. Zebravissen met een van de meest voorkomende NS mutaties in Shp2, D61G, vertonen defecten in hematopoëse die doen denken aan symptomen van juveniele myelomonocytische leukemie en een ontstekingsreactie. Het is opvallend dat een anti-ontstekingsmiddel het effect op hematopoëtische stamcellen en voorloper cellen grotendeels teniet doet.

Wij gebruiken ontwikkelende zebravis embryo’s als uitlezing voor Shp2 en Sos functie om inzicht te krijgen in de moleculaire mechanismes die ten grondslag liggen aan ontwikkelingsstoornissen. We hebben recent gevonden dat functioneel Shp2 en Sos nodig zijn voor normale lymphangiogenese in zebravis embryo’s. Reconstitutie van Shp2 in Shp2 knock-out embryo’s herstelde de vorming van het lymfevat stelsel. De analyse van het vermogen van Shp2 varianten om lymphangiogenese te herstellen in Shp2 knock-outs maakt het mogelijk om het mechanisme van de functie van  Shp2 op (sub)moleculair niveau te bepalen.

Biologisch actieve stoffen uit schimmels

Parallel aan bovenstaande onderzoekslijn is de afgelopen jaren een tweede onderzoekslijn ontwikkeld in het den Hertog lab, die erop gericht is om biologisch actieve stoffen te identificeren. Schimmels staan bekend om de productie van een grote variatie aan secundaire metabolieten met biologische activiteit. Veelgebruikte medicijnen zoals penicilline, cyclosporine en lovastatine zijn allemaal afkomstig van schimmels. Dat er continu nieuwe stoffen worden ontdekt die geproduceerd worden door schimmels, bewijst dat het schimmelrijk als bron van biologisch actieve stoffen nog lang niet uitgeput is. Wij hebben een bank gegenereerd van de groeimedia van 10.207 schimmels in samenwerking met het Westerdijk Instituut. Deze groeimedia bevatten de secundaire metabolieten die deze schimmels hebben uitgescheiden. Wij hebben de biologische activiteit bepaald in deze schimmel-filtraten met behulp van zebravis embryogenese als uitlezing. Zebravis embryo’s werden vanaf 6 uur na fertilisatie geïncubeerd met de schimmel supernatanten en 1.535 van de supernatanten veroorzaakten morfologische afwijkingen op 2 dagen na fertilisatie, variërend van een kronkelig notochord tot pigmentatie-, hart- en staartafwijkingen etc. Schimmelstammen zijn geselecteerd op basis van het fenotype dat zij induceerden en in samenwerking met het departement Scheikunde van de Universiteit Utrecht hebben we een pijplijn opgezet om bioactieve stoffen te isoleren met behulp van activiteits-gerichte zuivering met een HPLC. Gezuiverde actieve stoffen worden geïdentificeerd met behulp van chemische analyses, zoals LCMS, UV-Vis spectrometrie, hoge resolutie massa spectrometrie en NMR. We hebben de biologische activiteit in zebravis embryo’s van meer dan 100 bekende metabolieten uit schimmels vastgesteld en we hebben verscheidene bioactieve metabolieten gevonden die niet eerder beschreven zijn.