De Rabouille groep onderzoekt de celbiologie van stress bij Drosophila, de fruitvlieg.

De bezorging van nieuw gevormde eiwitten naar het plasmamembraan en de extracellulaire matrix gebeurt met membraanorganellen via de secretoire route. De Rabouille groep richt zich op de ER exit sites (ERES), die worden gekarakteriseerd door COPII en het ERES-eiwit Sec16. Dit moleculaire mechanisme wordt streng gecontroleerd en gereguleerd. In deze context wordt de rol van ERK7 in Drosophila S2-cellen bestudeerd. Deprivatie van aminozuren lijkt te leiden tot de vorming van nieuwe membraanloze stress assemblies, de Sec-bodies, en stressgranules.

Aminozuurtekort bij Drosophila leidt tot vorming van Sec bodies en stress granules, twee pro-survival stress assemblies

Gedurende de laatste jaren hebben we vooral gewerkt aan het identificeren van principes en factoren die belangrijk zijn voor de functionele organisatie van de vroege secretieroute (ER exit site (ERES) -Golgi) in gekweekte Drosophila S2-cellen (1, 2). In dit verband hebben wij de hydrofiele Drosophila-ortholoog Sec16 gekarakteriseerd, die essentieel is voor de biogenese en het onderhoud van ERES (3). Onlangs hebben we een RNAi-depletiemethode gebruikt met voorgeselecteerde vermoedelijke ER-eiwitten om nieuwe componenten te identificeren die betrokken zijn in de organisatie van het ERES (4).

Gezien de sterke regulatie van secretie en de organisatie van de vroege secretieroute door signalen (5), hebben we een groot project opgezet om de regulatie van secretie door nutrient signalering te verhelderen in Drosophila S2-cellen. In het bijzonder hebben we aangetoond dat secretie actief wordt geremd door serum tekorten, wat leidt tot het vrijkomen van Sec16 van het ER-membraan (6).

Anderzijds leidt een aminozuurtekort tot de vorming van omkeerbare niet-membraangebonden pro-survival stress assemblies, de Sec bodies, die de componenten van het ER exit sites bevatten, de Sec16- en COPII-componenten (7).

We hebben recent onderzocht of ADP-ribosylatie een rol speelt bij de vorming van stress assemblies. We hebben aangetoond dat PARP16 SEC16 MARyleert op een klein gebied, de SRDC, en dat dit voldoende is om de vorming van Sec bodies te induceren(8). We werken ook aan de rol van PARP1 in de vorming van stress granules.

Op dit moment zijn we bezig met het identificeren van de signaleringscomponenten die nodig zijn voor de vorming van deze assemblies. We testen ook of Sec bodies in vivo worden gevormd met behulp van het vetlichaam van Drosophila en of ze zich in zoogdiercellen vormen.

Een andere stress assembly, de stress granules, worden ook gevormd door aminozuurtekort. Stress granules vormen als gevolg van de inhibitie van eiwittranslatie, wat plaats vindt door vrijwel alle stresstypen. Dit leidt weer tot de accumulatie van niet-getransleerde mRNA’s die zijn gebonden aan specifieke RNA-bindende eiwitten en worden opgeslagen in stress granules of afgebroken in P-bodies (7).

Interessant is dat we hebben opgemerkt dat er een verbinding is tussen de vorming van beide structuren, de Sec bodies en stress granules. Momenteel onderzoeken we dit. We hebben verder aangetoond dat Sec16, een eiwit dat is gerelateerd aan ER-uitgangsplaatsen en eiwittransport, ook nodig is bij de vorming van stress granules, met name tijdens aminozuurtekort, omdat het een gewijzigde vorm van het RNA-bindende eiwit Rasputin bindt en het stabiliseert (9).

Asymmetrische verdeling van mRNA in de Drosophila ei-kamer: sub-compartimentering van P-bodies en translatiecontrole

In het verleden hebben we methodes ontwikkeld om op ultrastructureel niveau RNA-lokalisatie te visualiseren op basis van RNA-in situ-hybridisatie gekoppeld aan immuno-EM in vriescoupes. In samenwerking met de Davis-groep in Oxford, (UK), hebben we de lokalisatie van gurken (10) en bicoid ((11))-mRNA’s onderzocht in de Drosophila-eicel, zowel endogeen, geïnjecteerd en MS2 gelabeld.

Hoewel beide mRNA’s voorkomen in dezelfde cytoplasmatische structuren gelijkend op Processing Bodies (PB) in fase 9-eicellen, hebben we aangetoond dat hun sub-compartimenlisatie in PBs correleert met verschillende staten van translatie. (12). We bestuderen nu hoe dit de translatie van gurken reguleert in eicellen. We hebben aangetoond dat de transcriptor-activator Orb, die in hoge mate aanwezig is in de eicel en juist niet in de verpleegcellen, een belangrijke bepalende factor is in gurken-translatie (13).

GRASP-mutante muizen

Meestal worden nieuwe gesynthetiseerde eiwitten bestemd voor het plasmamembraan gesynthetiseerd in het ER. Deze gebruiken dan de klassieke secretieroute (ER> ER exit site> Golgi> PM) (14). Enkele jaren geleden hebben wij aangetoond dat in Drosophila sommige eiwitten het Golgi omzeilen op een dGRASP-afhankelijke manier (15) (16). Verrassend genoeg is  dGRASP een perifeer eiwit van het Golgi-apparaat en is het nodig voor vele aspecten van zijn biologie (17). Om de relevantie van deze route in zoogdieren te begrijpen, hebben we een KO-muis gegenereerd van één van de zoogdieren-homologen, GRASP65, dat geen fenotype laat zien onder groeicondities (18) weergeeft. In samenwerking met het Malhotra-lab in Barcelona (Spanje), zijn we nu bezig met het genereren van een dubbel-KO GRASP65 / GRASP55-muis.

Referenties

1. Kondylis V. Van Nispen tot Pannerden, H.E., Herpers, B., Friggi-Grelin, F. and Rabouille, C. The Golgi comprises a paired stack that is separated at G2 by modulation of the actin cytoskeleton through Abi and Scar:WAVE
Developmental Cell 12:901 (2007)

2. Kondylis V. and Rabouille C.
The Golgi apparatus – lessons from Drosophila
FEBS lett 583:3827 (2009)

3. Ivan V., De Voer, G., Xanthakis, D., Spoorendonk, K.M., Kondylis, V. and Rabouille, C.
Drosophila Sec16 mediates the biogenesis of tER sites upstream of Sar1 through an arginine-rich motif
Mol Biol Cell 19:4352 (2008)

4. Kondylis V., Tang, Y., Fuchs, F., Boutros, M. and Rabouille, C.
Identification of ER proteins involved in the functional organisation of the early secretory pathway in drosophila cells by a targed RNAi screen
PLOS One 6: e17173 (2011)

5. Farhan H. and Rabouille C.
Signaling to and from the secretory pathway
J Cell Sci 124:171 (2011)

6. Zacharogianni, M., V. Kondylis, Y. Tang, D. Xanthakis, H. Farhan, F. Fuchs, M. Boutros and C. Rabouille.
ERK7 is a negative regulator of protein secretion in response to amino-acid starvation by modulating Sec16 membrane association
EMBO J 30:3684-700 (2011)

7. Zacharogianni, M., A. Aguilera, J. Smout, T. Veenendaal, and C. Rabouille.
A stress assembly that confers cell viability by preseriving ERES components during amino-acid starvation
Elife 3: e04132 (2014)

8. Aguilera-Gomez A., Van Oorschot, M.M., Veenendaal, T. and Rabouille, C.
In vivo vizualisation of mono-ADP-riboylation by dPARP16 upon amino-acid starvation
Elife 3: e21475 (2016)

9. Aguilera-Gomez, A., Zacharogianni, M., Van Oorschot, M.M., Genau, H., Grond, R., Veenendaal, T., Sinsimer, K.S., Gavis, E.A., Behrends, C., Rabouille, C.
Phospho-rasputin stabilization by Sec16 is required for stress granule formation upon amino acid starvation
Cell Reports 20:935-948 (2017)

10. Delanoue R., Herpers, B., Davis, I. and Rabouille, C.
Drosophila Squid-hnRNP helps dynein switch from a gurken mRNA transport motor to an ultrastructural static anchor in sponge bodies
Developmental Cell 13:523 (2007)

11. Weil T.T., Xanthakis, D., Parton, R., Dobbie, I., Rabouille, C., Gavis, E.R. and Davis, I.
Distinguishing direct from indirect roles for bicoid mRNA localization factors
Development 137:169 (2010)

12. Weil, T.T., Parton, R.M., Herpers, B., Soetaert, J., Veenendaal, T., Xanthakis, D., Dobbie, I.M., Halstead, J., Hayashi, R., Rabouille, C.* and Davis, I.*
Drosophila patterning is established by differential association of mRNAs with P bodies
Nature Cell Biology 14:1305-13 (2012)

13. Davidson, A., Parton, R.M., Rabouille, C., Weil, T.T. and Davis, I.
Localized Translation of gurkenTGF-a mRNA during Axis Specification is Controlled by Access to OrbCPEB on Processing Bodies
Cell Reports 14:2451-2462 (2016)

14. Mellman I. and Warren W.
The road taken – past and future foundations of membrane traffic
Cell 100:99 (2000).

15. Rabouille, C.
Pathways of unconventional protein secretion
Trends Cell Biol. 27:230-240 (2017).

16. Grieve AG and Rabouille C
Golgi Bypass – Skirting Around the Heart of Classical Secretion
Cold Spring Harb Perspect Biol. 1;3(4) (2011).

17. Vinke F.P., Grieve, A.G. and Rabouille, C.
The multiple facets of the Golgi reassembly stacking proteins
Biochem J 433(3):423-433 (2011)

18. Veenendaal, T., Jarvela, T., Grieve, A.G., Van Es, J.H., Linstedt, A.D. and Rabouille, C.
GRASP65 controls the cis Golgi integrity in vivo
Biology Open 3:431 (2014).