De Clevers groep bestudeert de moleculaire mechanismen achter weefselontwikkeling en kanker van verschillende organen met behulp van organoïden die zijn gemaakt van volwassen Lgr5-stamcellen.

Tcf als Wnt-effector

In 1991 rapporteerden we het klonen van een T-cel-specifieke transcriptiefactor die we TCF1 (1) noemden. Verwante genen bestaan in genomen door het dierenrijk. We hebben in kikkers (4), vliegen (7) en wormen (11) aangetoond dat de TCF-eiwitten de effectoren vormen van de canonieke Wnt-route. Bij Wnt-signalering bindt en activeert ß-catenine nucleaire TCF’s door een trans-activeringsdomein aan te bieden. Voor deze studies hebben we de veel gebruikte pTOPFLASH Wnt-reporters ontworpen. Bij afwezigheid van Wnt-signalering, vonden we dat Tcf-factoren associëren met eiwitten van de Groucho-familie van transcriptionele repressoren om transcriptie van het doelwitgen (9) te onderdrukken.

Wnt-signalering bij kanker

Het tumorsuppressoreiwit APC vormt de kern van een cytoplasmatisch complex dat ß-catenine bindt en richt op degradatie in het proteasoom. In APC-deficiënte coloncarcinoomcellen hebben we aangetoond dat ß-catenine zich ophoopt en een constitutief complex vormt met het TCF-familielid TCF4, wat een moleculaire verklaring verschaft voor de start van darmkanker (5).

Wnt-signalering bij volwassen stamcellen

Bij zoogdieren is fysiologische Wnt-signalering nauw betrokken bij de biologie van volwassen stamcellen en zelf-vernieuwende weefsels (18,19). Wij waren de eersten die Wnt-signalering koppelden aan volwassen stamcelbiologie, toen we aantoonden dat de verstoring van het TCF4-gen de vorming van crypten in de dunne darm verhindert (8), en dat knock-out van het TCF1-gen het stamcelcompartiment van de thymus ernstig uitschakelt (2). Het door TCF4 aangestuurde doelwitgen bij colorectale kankercellen is de kwaadaardige tegenhanger van een fysiologisch genprogramma in zelfvernieuwende crypts (13, 14, 21).

Een GFP-knock-in in de Lgr5-locus visualiseert de stamcellen van de dunne darm aan de basis van crypten bij muizen (23)

Lgr5 als adulte stamcelmarker

Onder de Wnt-doelgenen vonden we het Lgr5-gen uniek omdat het kleine cycling cells kenmerkt in de bodem van crypten. Deze cellen vertegenwoordigen de epitheliale stamcellen van de dunne darm en dikke darm (23), de haarzak (24), de maag (28) en – waarschijnlijk – alle andere epitheliale stamcellen van het zoogdierlichaam. Ze vertegenwoordigen ook de oorsprongscellen van adenomen in de darm (25), waarin Lgr5-stamcellen werken als adenoomstamcellen (36). Het verwante Lgr6 markeert multipotente huidstamcellen (29).

Lgr5-stamcelbiologie

Lgr5-positieve cryptestamcellen gedragen zich op onverwachte manieren: ze delen constant. De aantallen stamcellen blijven vast omdat stamcellen ‘neutraal’ concurreren voor niche-ruimte. Ze splitsen zich dus niet asymmetrisch (32), een fenomeen dat werd bevestigd door in vivo-beeldvorming (43). Dochters van de dunne darm-stamcellen, de Paneth-cellen, dienen als crypt niche-cellen door het verschaffen van Wnt-, Notch- en EGF-signalen (30). Het Wnt-doelwitgen dat codeert voor de transcriptiefactor Achaete scute-achtige 2 bestuurt het lot van de intestinale stamcel (26).

Lgr5 is de R-spondin-receptor

Lgr5 is te vinden in Wnt-receptorcomplexen en medieert de signalering van R-spondin-Wnt-agonisten (33), dat de unieke afhankelijkheid van Lgr5-stamcellen van verschillende epithelia op R-spondins in vivo en in vitro verklaart. Twee andere Wnt-doelgenen, RNF43 en ZNRF3, coderen voor stamcelspecifieke E3-ligasen die Wnt-receptoren neerwaarts reguleren. In een negatieve feedbacklus regelen ze de grootte van de stamcelzone (35). Onafhankelijk werk van het Feng Cong-lab heeft eerst aangetoond dat R-spondin, wanneer gebonden aan Lgr5, RNF43 / ZNRF3 afvangt en inactiveert.

Langdurige klonale kweek van organoïden uit Lgr5-stamcellen

Wnt-signalering heeft een interactie met de BMP- en Notch-cascades om proliferatie aan te sturen en differentiatie in intestinale crypten en adenomen te remmen (17, 20). Op basis van deze gecombineerde inzichten hebben we op Lgr5 / R-spondin gebaseerde kweeksystemen ontwikkeld die de uitgroei van enkele muizen- of menselijke Lgr5-stamcellen mogelijk maken in steeds groter wordende minidarmen (27, 31), miniemagen (28), darmkankerorganoïden (31, 48) leverorganoïden (39, 46), prostaatorganoïden (45), organoiden van borstkanker (53) en organoïden die meerdere andere volwassen weefsels vertegenwoordigen. Deze epitheelorganoïdeculturen zijn genetisch en fenotypisch extreem stabiel, wat transplantatie van de gekweekte nakomelingen van een enkele stamcel mogelijk maakt, evenals ziektemodellering door organoïden direct uit zieke patiëntenweefsels te laten groeien (46). De directe klonering van meerdere afzonderlijke cellen uit primaire tumoren maakt moleculaire en functionele analyse van tumorheterogeniteit mogelijk met een ongekende resolutie (54). Menselijke organoïden zijn gemakkelijk ontvankelijk voor CRISP-gemedieerde genoommodificatie om bijvoorbeeld maligne transformatie (49) en mutagenese na defect DNA-herstel te modelleren (52).

Als proof-of-concept werd de CFTR-locus gerepareerd in individuele darmstamcellen van twee patiënten met taaislijmziekte, met behulp van CRISPR / Cas9-technologie in combinatie met homologe recombinatie. Gerepareerde stamcellen werden klonaal uitgebreid tot minidarmpjes en bleken een ​​functioneel CFTR-kanaal (43) te bevatten. De op organoïden gebaseerde zwellingstest is intussen de klinische praktijk geworden in Nederland om een ​​patiënt te identificeren met zeldzame mutaties die reageren op de Vertex-geneesmiddelen. Daarom hebben we de non-profit HUB-stichting opgericht, die momenteel een biobank bouwt van alle 1500 Nederlandse CF-patiënten. Deze wordt gefinancierd door onze nationale verzekeringsmaatschappijen. De HUB onderhoudt ook grote biobanken van colon-, borst-, long- en alvleesklierorganoïden, toegankelijk voor de academische wereld en het bedrijfsleven.

Selected publications

1) van de Wetering, M., Oosterwegel, M., Dooijes, D., and Clevers, H.C. Identification and cloning of TCF-1, a T cell-specific transcription factor containing a sequence-specific HMG box.
EMBO J ., 10:123-132 (1991)

2) Verbeek, J.S., Ison, D., Hofhuis, F., Robanus-Maandag, E., te Riele, H., van de Wetering, M., Oosterwegel, M., Wilson, A., MacDonald, H.R. and Clevers, H.C. An HMG box containing T-cell factor required for thymocyte differentiation.
Nature 374: 70-74 (1995)

3) Schilham, M., Oosterwegel, M., Moerer, P., Jing Ya, de Boer, P., van de Wetering, M., Verbeek, S., S., Lamers, W., Kruisbeek, A., Cumano, A., and Clevers, H .Sox-4 gene is required for cardiac outflow tract formation and pro-B lymphocyte expansion.
Nature , 380: 711-714 (1996)

4) Molenaar, M., Van de Wetering, M., Oosterwegel, M., Peterson-Maduro, J., Godsave, S., Korinek, V., Roose, J., Destrée, O. And Clevers, H. Xtcf-3 Transcription factor mediates beta-catenin-induced axis formation in xenopus embryos.
Cell , 86, 391-399 (1996)

5) Korinek, V, Barker, N., Morin, P.J., van Wichen, D., de Weger, R., Kinzler, K.W., Vogelstein, B., and Clevers, H. Constitutive Transcriptional Activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC -/- Colon Carcinoma.
Science , 275: 1784-1787 (1997)

6) Morin, P.J., Sparks, A., Korinek, V., Barker, N., Clevers, H., Vogelstein, B., and Kinzler, K. Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC.
Science 275: 1787-1790 (1997)

7) Van de Wetering, M., Cavallo, R., Dooijes, D., Van Beest, M., Van Es, J., Loureiro, J., Ypma, A., Hursh, D., Jones, T., Bejsovec, A., Peifer, M., Mortin, M., and Clevers, H. Armadillo co-activates transcription driven by the product of the Drosophila segment polarity gene dTCF .
Cell , 88, 789-799 (1997)

8) Korinek, V., Barker, N., Moerer, P., van Donselaar, E., Huls, G., Peters, P.J. and Clevers, H. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4.
Nat Genet 19(4): 379-383 (1998)

9) Roose, J., Molenaar, M., Peterson, J., Hurenkamp, J., Brantjes, H., Moerer, P., van de Wetering, M., Destree, O., and Clevers, H. The Xenopus Wnt effector XTcf-3 interacts with Groucho-related transcriptional repressors.
Nature 395(6702): 608-612 (1998)

10) Roose, J., Huls, G., van Beest, M., Moerer, P., van der Horn, K., Goldschmeding, R., Logtenberg, T., and Clevers, H. Synergie between tumor suppressor APC and the beta-catenin/Tcf4 target gene Tcf1. 
Science 
285: 1923-1926 (1999)

11) Korswagen, R., Herman, M. and Clevers, H. Separate beta-catenins mediate Wnt signaling and cadherin adhesion in C. elegans.
Nature 406: 527-532 (2000)

12) Bienz, M., and Clevers, H. Linking colorectal cancer to Wnt signaling. Review
Cell 103: 311-320 (2000)

13) Van de Wetering, M., Sancho, E., Verweij, C., de Lau, W., Oving, I., Hurlstone, A., Van der Horn, K., Batlle, E., Coudreuse, D., Haramis, A-P., Tjon-Pon-Fong, M., Moerer, P., Van den Born, M., Soete, G., Pals, S., Eilers, M., Medema, R., Clevers, H. The beta-catenin/TCF4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells.
Cell 111: 241-250 (2002)

14) Battle, E., Henderson, J.T., Beghtel, H., van den Born, M., Sancho, E., Huls, G., Meeldijk, J., Robertson, J., van de Wetering, M., Pawson, T., Clevers, H. Beta- catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB.
Cell 111: 251-263 (2002)

15) Hurlstone A.F., Haramis A.P., Wienholds E., Begthel H., Korving J., Van Eeden F., Cuppen E., Zivkovic D., Plasterk R.H., Clevers H. , The Wnt/beta-catenin pathway regulates cardiac valve formation.
Nature 425:633-7 (2003)

16) Baas A.F., Kuipers J., van der Wel N.N., Batlle E., Koerten H.K., Peters P.J., Clevers H.C. , Complete polarization of single intestinal epithelial cells upon activation of LKB1 by STRAD.
Cell. 116:457-66 (2004)

17) Haramis A.P., Begthel H., van den Born M., van Es J., Jonkheer S., Offerhaus G.J., Clevers H. , De novo crypt formation and Juvenile Polyposis upon BMP inhibition
Science. 303:1684-6 (2004)

18) Radtke, F and Clevers, H., Self-renewal and cancer of the gut: Two sides of a coin. Review
Science. 307:1904-1909 (2005)

19) Reya T., Clevers H., Wnt signalling in stem cells and cancer. Review
Nature 434:843-850 (2005)

20) Van Es J.H., Van Gijn M.E., Riccio O., Van den Born M., Vooijs M., Begthel H., Cozijnsen M., Robine S., Winton D.J., Radtke F., Clevers H. Notch pathway/gamma-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and neoplasia into Goblet cells.
Nature 435:959-963 (2005)

21) Batlle E., Bacani J., Begthel H., Jonkheer S., Gregorieff A., Van de Born M., Malats N., Sancho E., Boon E., Pawson T., Gallinger S., Pals S., Clevers H., EphB activity suppresses colorectal cancer progression
Nature 435:1126-1130 (2005)

22) Clevers, H. Wnt/ß-catenin signaling in development and disease.
Cell 127: 469-480 (2006)

23) Barker, N, van Es, J.H., Kuipers, J., Kujala P., van den Born, M., Cozijnsen, M., Korving, J., Begthel, H., Peters, P.C., and Clevers, H. Identification of Stem Cells in Small Intestine and Colon by a Marker Gene LGR5 
Nature, 449:1003-1007 (2007)

24) Jaks V., Barker N., Kasper M., van Es J.H., Snippert H.J., Clevers H., Toftgård R. Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells.
Nat Genet. 40 : 1291-1299 (2008)

25) Barker N., Ridgway R.A., van Es J.H.,van de Wetering M., Begthel H., van den Born M., Danenberg E., Clarke A.R., Sansom O.J., Clevers H. Crypt Stem Cells as the Cells-of-Origin of Intestinal Cancer
Nature 457:608-611(2009)

26) van der Flier, L.G., van Gijn, M.E., .., and Clevers H. Transcription factor Achaete scute-like 2 (Ascl2) controls intestinal stem cell fate
Cell 136: 903-12 (2009)

27) Sato, T., Vries, R., Snippert, H., van de Wetering, M., Barker, N., Stange, D., van Es, J., Abo, A., Kujala, P., Peters, P., and Clevers, H. Single lgr5 gut stem cells build crypt-villus structures in vitro without a stromal niche 459(7244):262-5
Nature 459 :262-5 (2009)

28) Barker, N, Huch, M., …, and Hans Clevers.  Lgr5+ve stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro
Cell Stem Cell, 6: 25-36 (2010)

29) Snippert, H.J., Haegebarth, A., Kasper, M., Jaks, V., van Es, J.H., Barker, N., van de Wetering,
M., van den Born, M., Begthel, H., Vries, R.G., Stange, D.E., Toftgård, R., Clevers H.  Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin.
Science 327: 1385-1389 (2010)

30) Sato, T., van Es, J.H., Snippert, H.J., Stange, D.E., Vries, R.G., van den Born, M., Barker, N., Shroyer, N.F., van de Wetering, M., Clevers, H. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.
Nature 469: 415-418 (2010)

31) Snippert, .J., van der Flier, L.G., Sato, T., van Es, J.H., van den Born, M., Kroon-Veenboer, C., Barker, N.,Klein, A.M., van Rheenen, J. Benjamin D. Simons, B.D. and Clevers, H. Intestinal Crypt Homeostasis results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells.
Cell 143:134-44 (2010)

32) de Lau, W., Barker, N., … and Clevers, H. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signaling
Nature 476: 293-297 (2011)

33) Li, V.S., Ng, S.S., Boersema, P.J., Low, T.Y., Karthaus, W.R., Gerlach, J.P., Mohammed, S., Heck, A.J., Maurice, M.M., Mahmoudi, T. and Clevers H. Wnt signaling inhibits proteasomal β-catenin degradation within a compositionally intact Axin1 complex.
Cell  149: 1245-1256 (2012)

34) Koo, B-K., Spit, M. Jordens, I., Low, T.Y., Stange, D.E., van de Wetering, M., van Es, J.H., Mohammed, S., Heck, A.J.R., Maurice, M.M. and Hans Clevers. Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.
Nature 488: 665-669 (2012)

35) Schepers, A.G., Snippert, H.J., Stange, D.E., van den Born, M., van Es, J.H., van de Wetering, M., Clevers, H. Lineage Tracing Reveals Lgr5+ Stem Cell Activity in Mouse Intestinal Adenomas. Science337: 730-735 (2012)

36) van Es, J.H., Sato, T., van de Wetering, M., Lyubimova, A., Yee Nee, A.N., Gregorieff, A., Sasaki, N., Zeinstra, L., van de Born, M., Korving, J., Martens, A.C., Barker, N., van Oudenaarden, A., Clevers, H. DII (+) secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.
Nat Cell Biol 14: 1099-1104 (2012)

37) Boj, S,F., van Es, J.H.,Huch. M., Li, V.S., Jose, A., Hatzis, P., Mokry, M., Haegebarth, A., van den Born, M., Chambon, P., Voshol, P., Dor, Y., Cuppenm E., Fillat, C., Clevers, H. Diabetes risk gene and Wnt effector Tcf7l2/TCF4 controls hepatic response to perinatal and adult metabolic demand.
Cell 151: 1595-1607 (2012)

38) Huch M., Dorell, C., Boj, S.F., van Es, J.H., van de Wetering, M., Li, V.S.W., Hamer, K., Sasaki, N., Finegold, M.J., Haft, A., Grompe, M., Clevers, H. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.
Nature 494: 247-250 (2013)

39) Sato, T., Clevers, H., Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cells: mechanism and applications. Review
Science 340: 1190-1194 (2013)

40) Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment.
Cell 154: 274-284 (2013)

41) Stange, D.E., Koo, B.K., Huch, M., Sibbel, G., Basak, O., Lyubimova, A.,Kujalla, P., Bartfeld, S., Koster, J., Geahlen, J.H., Peters, P.J., van Es, J., van de Wetering, M., Mills, J.C., Clevers, H. Differentiated Troy+ chief cells act as ‘reserve’ stem cells to generate all lineages of stomach epithelium.
Cell 155: 357-368 (2013)

42) Schwank, G., Koo, B.K., Sasselli, V., Dekkers, J.F., Heo, I., Demircan, T., Sasaki, N., Boymans, S., Cuppen, E., van der Ent, C.K., Nieuwenhuis, E.E., Beekman, J.M. and Clevers, H. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.
Cell Stem Cell 13: 653-658 (2013)

43) Ritsma, L., Ellenbroek, S.I., Zomer, A., Snippert, H.J., de Sauvage, F.J., Simons, B.D., Clevers, H., van Rheenen, J.. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo imaging.
Nature 507: 362-5 (2014)

44) Karthaus, W.R., Iaquinta, P.J., Drost, J., Gracanin, A.., van Boxtel, R., Wongvipat, J., Dowling, C.M., Gao, D., Begthel, H., Sachs, N., Vries, R.G., Cuppen, E., Chen, Y., Sawyers, C.L., Clevers, H.C. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.
Cell 159: 163-75 (2014).

45) Huch, M., Gehart, H., van Boxtel, R., Hamer, K., Blokzijl, F., Verstegen, M.A., Ellis, E., van Wenum, M., Fuchs, S., de Ligt, S., van de Wetering, M., Sasaki, N., Boers, S.J., Kemperman, H., de Jonge, J., Ijzermans, J.N.M., Niewenhuis, E.E.S., Hoekstra, R., Strom, S., Vries, R.G.J., van der Laan, L.J.W., Cuppen, E., Clevers, H. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver
Cell 160: 299-312 (2015)

46) Boj, S.F., Hwang, C.I., Baker, L.A., Chio, I.I., Engle, D.D., Corbo, V., Jager, M., Ponz-Sarvise, M., Tiriac, H., Spector, M.S., Gracanin, A., Oni, T., Yu, K.H., van Boxtel, R., Huch, M., Rivera, K.D., Wilson, J.P., Feigin, M.E., Öhlund, D., Handly-Santana, A., Ardito-Abraham, C.M., Ludwig, M., Elyada, E., Alagesan, B., Biffi, G., Yordanov, G.N., Delcuze, B., Creighton, B., Wright, K., Park, Y., Morsink, F.H., Molenaar, I.Q., Borel Rinkes, I.H., Cuppen, E., Hao, Y., Jin, Y., Nijman, I.J., Iacobuzio-Donahue, C., Leach, S.D., Pappin, D.J., Hammell, M., Klimstra, D.S., Basturk, O., Hruban RH, Offerhaus GJ, Vries RG, Clevers H, Tuveson DA. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.
Cell 160: 324-338 (2015)

47) van de Wetering, M., Francies, H.E., Francis, J.M., Bounova, G., Iorio, F., Pronk, A., van Houdt, W., van Gorp, J., Taylor-Weiner, A., Kester, L., McLaren-Douglas, A., Blokker, J., Jaksani, S., Bartfeld, S., Volckman, R., van Sluis, P., Li, V.S.W., Seepo, S., Sekhar Pedamallu, C., Cibulskis, C., Carter, S.L., McKenna, A., Lawrence, M.S., Lichtenstein, L., Stewart, C., Koster, J., Versteeg, R., van Oudenaarden, A., Saez-Rodriguez, J., Vries, R.G.J., Getz, G., Wessels, L., Stratton, M.R., McDermott, U., Meyerson, M., Garnett, M.J., Clevers, H. Prospective derivation of a ‘Living Organoid Biobank’ of colorectal cancer patients.
Cell 161: 933-945 (2015)

48) Drost, J, van Jaarsveld, R.H., Ponsioen, B., Zimberlin, C., van Boxtel, R., Buijs, A.,Sachs, N., Overmeer, R.M., Offerhaus, G.J., Begthel, H. Korving, J., van de Wetering, M., Schwank, G. Logtenberg, M., Cuppen, E., Snippert, H.J., Medema, J.P., Kops, G. J. P. L., Clevers, H. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells.
Nature 521: 43-47 (2015)

49) Farin, H.F., Jordens, I., Mosa, M.H., Basak, O., Korving, J., Tauriello, D.V.F., de Punder, K., Angers, S., Peters, P.J. Maurice, M.M. and Clevers, H. Visualization of the short-range Wnt gradient in the intestinal stem cell niche. Nature 530: 340-343 (2016)

50) Clevers, H. Modeling development and disease with organoids Cell 165:1586-1597 (2016)

51) Boj, S.F., Vonk, A.M., Statia, M., Su, J., Vries, R.R.G., Beekman, J.M., Clevers, H. Forskolin-Induced Swelling in Intestinal Organoids: An in vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients.
Journal of Visualized Experiments (JoVE) 120 (2017)

52) Drost, J., van Boxtel, R., Blokzijl, F., Mizutani, T., Sasaki, N., Sasselli, V., de Ligt, J., Behjati, S., Grolleman, J.E., van Wezel, T., Nik-Zainal, S., Kuiper, R.P., Cuppen, E., and Clevers, H. Use of CRISPR-modified human stem cell organoids to study the origin of mutational signatures in cancer.
Science1126/science.aao3130 (2017)