Tcf als Wnt effector

In 1991 rapporteerden we de klonering van een T-cel specifieke transcriptiefactor die we TCF1 noemden (1). Gerelateerde genen bestaan in genomen binnen het dierenrijk. We hebben laten zien in kikkers (4), vliegen (7) en wormen (11) dat de TCF-eiwitten de effectoren van de canonische Wnt signaleringsroute vormen. Bij Wnt signalering bindt ß-catenine aan en activeert het nucleaire TCFs door een trans-activatie domein aan te bieden. Voor deze studies ontwierpen we de alom gebruikte pTOPFLASH Wnt reporters. In de afwezigheid van Wnt signalering vonden we dat Tcf factoren associëren met eiwitten van de Groucho familie van transcriptionele repressoren om transcriptie van targetgenen te onderdrukken (9).

Wnt signalering in kanker

Het tumorsuppressor eiwit APC vormt de kern van een cytoplasmatisch complex dat ß-catenine bindt en het tot target maakt voor degradatie in het proteosoom. In APC-deficiënte colon carcinoma cellen toonden we aan dat ß-catenine accumuleert en constitutief een complex vormt met het TCF familielid TCF4, wat een moleculaire verklaring geeft voor de initiatie van dikkedarmkanker (5).

Wnt signalering in volwassen stamcellen

In zoogdieren is fysiologische Wnt signalering sterk betrokken bij de biologie van volwassen stamcellen en zelfvernieuwend weefsel (18,19). Wij waren de eersten die Wnt signalering koppelden aan volwassen stamcelbiologie toen we aantoonden dat TCF4 gendisruptie leidt tot de eliminatie van crypten van de dunne darm (8), en dat TCF1 genuitschakeling het stamcelcompartiment van de thymus ernstig belemmert (2). Het Tcf4-gedreven target-genprogramma in colorectale kankercellen is de kwaadaardige tegenhanger van een fysiologisch genprogramma in zelfvernieuwende crypten (13, 14, 21).

Lgr5 als volwassen stamcelmarker

Binnen de Wnt targetgenen ontdekten we dat het Lgr5 gen uniek is in het feit dat het kleine zichzelf delende cellen markeert op onder in de crypten. Deze cellen representeren de epitheliale stamcellen van de dunne en dikke darm (23), haarfollikels (24), de maag (28) en stamceltypes van vele andere weefsels. Ze representeren ook de cellen van herkomst van adenoma’s in de darmen (25) en binnen adenoma’s gedragen Lgr5 stamcellen zich als adenoma stamcellen (36). Lgr6 markeert multipotente huidstamcellen (29).

Lgr5 stamcelbiologie

Lgr5 crypt stamcellen gedragen zich tegen de verwachting in: ze delen constant en op een symmetrische manier. Het aantal stamcellen blijft constant, omdat stamcellen “neutraal” competeren voor ruimte in de niche. Daarom delen ze niet asymmetrisch (31), een fenomeen dat bevestigd werd door in vivo imaging (43). Dochters van de dunnedarm stamcellen, Panetcellen genaamd, dienen als crypt niche-cellen door het voorzien in Wnt, Notch en EGF signalen (30).

Het Wnt targetgen dat codeert voor de transcriptiefactor Achaete scute-like 2 bepaalt het lot van darmstamcel (26).

Lgr5 is de R-spondin receptor

Lgr5 verblijft in Wnt receptor complexen en medieert signalering van de R-spondin Wnt agonisten (32), wat de unieke afhankelijkheid van Lgr5 stamcellen voor R-spondins in vivo en in vitro verklaart. Twee andere Wnt targetgenen, RNF43 en ZNRF3, coderen voor stamcel-specifieke E3 ligases die Wnt receptoren downreguleren. Ze zijn deel van een negatieve feedbackloop om toezicht te houden op de grootte van de stamcelzone (34). Onafhankelijk werk van het lab van Feng Cong heeft eerder aangetoond dat R-spondin, wanneer het gebonden is aan Lgr5, RNF43/ZNRF3 wegvangt en inactiveert.

Lange-termijn klonale kweek van organoïden vanuit Lgr5 stamcellen

Wnt signalering heeft een nauwe wisselwerking met de BMP en Notch cascades om proliferatie te stimuleren en differentiatie te remmen in darmcrypten en adenoma’s (17, 20). Gebaseerd op deze gecombineerde inzichten hebben wij Lgr5/R-spondin-gebaseerde kweeksystemen ontwikkeld die mogelijk maken dat vanuit losse muizen- of humane Lgr5 stamcellen mini-organen ontstaan die oneindig kunnen expanderen, zoals mini-darmen (27), mini-magen (28), leverorganoïden (38, 45), prostaatorganoïden (44) en organoïden die andere volwassen weefsels representeren. Deze epitheliale organoïdekweken zijn genetisch en fenotypisch extreme stabiel, wat transplantatie van de gekweekte nakomelingen van een losse stamcel mogelijk maakt, als ook het modelleren van ziekten door organoïden rechtstreeks vanuit patiëntenweefsel te kweken (45). 

 Als proof-of-concept is de CFTR locus in losse darmstamcellen van twee Cystic Fibrose patiënten gerepareerd, gebruikmakend van de CRISPR/Cas9 technologie samen met homologe recombinatie. Gerepareerde stamcellen werden klonaal geëxpandeerd tot mini-darmen en het werd aangetoond dat ze een functioneel CFTR kanaal bezaten (42).

Selected publications

1) van de Wetering, M., Oosterwegel, M., Dooijes, D., and Clevers, H.C. Identification and cloning of TCF-1, a T cell-specific transcription factor containing a sequence-specific HMG box.
EMBO J ., 10:123-132 (1991)

2) Verbeek, J.S., Ison, D., Hofhuis, F., Robanus-Maandag, E., te Riele, H., van de Wetering, M., Oosterwegel, M., Wilson, A., MacDonald, H.R. and Clevers, H.C. An HMG box containing T-cell factor required for thymocyte differentiation.
Nature 374: 70-74 (1995)

3) Schilham, M., Oosterwegel, M., Moerer, P., Jing Ya, de Boer, P., van de Wetering, M., Verbeek, S., S., Lamers, W., Kruisbeek, A., Cumano, A., and Clevers, H .Sox-4 gene is required for cardiac outflow tract formation and pro-B lymphocyte expansion.
Nature , 380: 711-714 (1996)

4) Molenaar, M., Van de Wetering, M., Oosterwegel, M., Peterson-Maduro, J., Godsave, S., Korinek, V., Roose, J., Destrée, O. And Clevers, H. Xtcf-3 Transcription factor mediates beta-catenin-induced axis formation in xenopus embryos.
Cell , 86, 391-399 (1996)

5) Korinek, V, Barker, N., Morin, P.J., van Wichen, D., de Weger, R., Kinzler, K.W., Vogelstein, B., and Clevers, H. Constitutive Transcriptional Activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC -/- Colon Carcinoma.
Science , 275: 1784-1787 (1997)

6) Morin, P.J., Sparks, A., Korinek, V., Barker, N., Clevers, H., Vogelstein, B., and Kinzler, K. Activation of beta-catenin-Tcf signaling in colon cancer by mutations in beta-catenin or APC.
Science 275: 1787-1790 (1997)

7) Van de Wetering, M., Cavallo, R., Dooijes, D., Van Beest, M., Van Es, J., Loureiro, J., Ypma, A., Hursh, D., Jones, T., Bejsovec, A., Peifer, M., Mortin, M., and Clevers, H. Armadillo co-activates transcription driven by the product of the Drosophila segment polarity gene dTCF .
Cell , 88, 789-799 (1997)

8) Korinek, V., Barker, N., Moerer, P., van Donselaar, E., Huls, G., Peters, P.J. and Clevers, H. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4.
Nat Genet 19(4): 379-383 (1998)

9) Roose, J., Molenaar, M., Peterson, J., Hurenkamp, J., Brantjes, H., Moerer, P., van de Wetering, M., Destree, O., and Clevers, H. The Xenopus Wnt effector XTcf-3 interacts with Groucho-related transcriptional repressors.
Nature 395(6702): 608-612 (1998)

10) Roose, J., Huls, G., van Beest, M., Moerer, P., van der Horn, K., Goldschmeding, R., Logtenberg, T., and Clevers, H. Synergie between tumor suppressor APC and the beta-catenin/Tcf4 target gene Tcf1. 
Science 
285: 1923-1926 (1999)

11) Korswagen, R., Herman, M. and Clevers, H. Separate beta-catenins mediate Wnt signaling and cadherin adhesion in C. elegans.
Nature 406: 527-532 (2000)

12) Bienz, M., and Clevers, H. Linking colorectal cancer to Wnt signaling. Review
Cell 103: 311-320 (2000)

13) Van de Wetering, M., Sancho, E., Verweij, C., de Lau, W., Oving, I., Hurlstone, A., Van der Horn, K., Batlle, E., Coudreuse, D., Haramis, A-P., Tjon-Pon-Fong, M., Moerer, P., Van den Born, M., Soete, G., Pals, S., Eilers, M., Medema, R., Clevers, H. The beta-catenin/TCF4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells.
Cell 111: 241-250 (2002)

14) Battle, E., Henderson, J.T., Beghtel, H., van den Born, M., Sancho, E., Huls, G., Meeldijk, J., Robertson, J., van de Wetering, M., Pawson, T., Clevers, H. Beta- catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB.
Cell 111: 251-263 (2002)

15) Hurlstone A.F., Haramis A.P., Wienholds E., Begthel H., Korving J., Van Eeden F., Cuppen E., Zivkovic D., Plasterk R.H., Clevers H. , The Wnt/beta-catenin pathway regulates cardiac valve formation.
Nature 425:633-7 (2003)

16) Baas A.F., Kuipers J., van der Wel N.N., Batlle E., Koerten H.K., Peters P.J., Clevers H.C. , Complete polarization of single intestinal epithelial cells upon activation of LKB1 by STRAD.
Cell. 116:457-66 (2004)

17) Haramis A.P., Begthel H., van den Born M., van Es J., Jonkheer S., Offerhaus G.J., Clevers H. , De novo crypt formation and Juvenile Polyposis upon BMP inhibition
Science. 303:1684-6 (2004)

18) Radtke, F and Clevers, H., Self-renewal and cancer of the gut: Two sides of a coin. Review
Science. 307:1904-1909 (2005)

19) Reya T., Clevers H., Wnt signalling in stem cells and cancer. Review
Nature 434:843-850 (2005)

20) Van Es J.H., Van Gijn M.E., Riccio O., Van den Born M., Vooijs M., Begthel H., Cozijnsen M., Robine S., Winton D.J., Radtke F., Clevers H. Notch pathway/gamma-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and neoplasia into Goblet cells.
Nature 435:959-963 (2005)

21) Batlle E., Bacani J., Begthel H., Jonkheer S., Gregorieff A., Van de Born M., Malats N., Sancho E., Boon E., Pawson T., Gallinger S., Pals S., Clevers H., EphB activity suppresses colorectal cancer progression
Nature 435:1126-1130 (2005)

22) Clevers, H. Wnt/ß-catenin signaling in development and disease.
Cell 127: 469-480 (2006)

23) Barker, N, van Es, J.H., Kuipers, J., Kujala P., van den Born, M., Cozijnsen, M., Korving, J., Begthel, H., Peters, P.C., and Clevers, H. Identification of Stem Cells in Small Intestine and Colon by a Marker Gene LGR5 
Nature, 449:1003-1007 (2007)

24) Jaks V., Barker N., Kasper M., van Es J.H., Snippert H.J., Clevers H., Toftgård R. Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells.
Nat Genet. 40 : 1291-1299 (2008)

25) Barker N., Ridgway R.A., van Es J.H.,van de Wetering M., Begthel H., van den Born M., Danenberg E., Clarke A.R., Sansom O.J., Clevers H. Crypt Stem Cells as the Cells-of-Origin of Intestinal Cancer
Nature 457:608-611(2009)

26) van der Flier, L.G., van Gijn, M.E., .., and Clevers H. Transcription factor Achaete scute-like 2 (Ascl2) controls intestinal stem cell fate
Cell 136: 903-12 (2009)

27) Sato, T., Vries, R., Snippert, H., van de Wetering, M., Barker, N., Stange, D., van Es, J., Abo, A., Kujala, P., Peters, P., and Clevers, H. Single lgr5 gut stem cells build crypt-villus structures in vitro without a stromal niche 459(7244):262-5
Nature 459 :262-5 (2009)

28) Barker, N, Huch, M., …, and Hans Clevers.  Lgr5+ve stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro
Cell Stem Cell, 6: 25-36 (2010)

29) Snippert, H.J., Haegebarth, A., Kasper, M., Jaks, V., van Es, J.H., Barker, N., van de Wetering,
M., van den Born, M., Begthel, H., Vries, R.G., Stange, D.E., Toftgård, R., Clevers H.  Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin.
Science 327: 1385-1389 (2010)

30) Sato, T., van Es, J.H., Snippert, H.J., Stange, D.E., Vries, R.G., van den Born, M., Barker, N., Shroyer, N.F., van de Wetering, M., Clevers, H. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.
Nature 469: 415-418 (2010)

31) Snippert, .J., van der Flier, L.G., Sato, T., van Es, J.H., van den Born, M., Kroon-Veenboer, C., Barker, N.,Klein, A.M., van Rheenen, J. Benjamin D. Simons, B.D. and Clevers, H. Intestinal Crypt Homeostasis results from Neutral Competition between Symmetrically Dividing Lgr5 Stem Cells.
Cell 143:134-44 (2010)

32) de Lau, W., Barker, N., … and Clevers, H. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signaling
Nature 476: 293-297 (2011)

33) Li, V.S., Ng, S.S., Boersema, P.J., Low, T.Y., Karthaus, W.R., Gerlach, J.P., Mohammed, S., Heck, A.J., Maurice, M.M., Mahmoudi, T. and Clevers H. Wnt signaling inhibits proteasomal β-catenin degradation within a compositionally intact Axin1 complex.
Cell  149: 1245-1256 (2012)

34) Koo, B-K., Spit, M. Jordens, I., Low, T.Y., Stange, D.E., van de Wetering, M., van Es, J.H., Mohammed, S., Heck, A.J.R., Maurice, M.M. and Hans Clevers. Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.
Nature 488: 665-669 (2012)

35) Schepers, A.G., Snippert, H.J., Stange, D.E., van den Born, M., van Es, J.H., van de Wetering, M., Clevers, H. Lineage Tracing Reveals Lgr5+ Stem Cell Activity in Mouse Intestinal Adenomas. Science337: 730-735 (2012)

36) van Es, J.H., Sato, T., van de Wetering, M., Lyubimova, A., Yee Nee, A.N., Gregorieff, A., Sasaki, N., Zeinstra, L., van de Born, M., Korving, J., Martens, A.C., Barker, N., van Oudenaarden, A., Clevers, H. DII (+) secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.
Nat Cell Biol 14: 1099-1104 (2012)

37) Boj, S,F., van Es, J.H.,Huch. M., Li, V.S., Jose, A., Hatzis, P., Mokry, M., Haegebarth, A., van den Born, M., Chambon, P., Voshol, P., Dor, Y., Cuppenm E., Fillat, C., Clevers, H. Diabetes risk gene and Wnt effector Tcf7l2/TCF4 controls hepatic response to perinatal and adult metabolic demand.
Cell 151: 1595-1607 (2012)

38) Huch M., Dorell, C., Boj, S.F., van Es, J.H., van de Wetering, M., Li, V.S.W., Hamer, K., Sasaki, N., Finegold, M.J., Haft, A., Grompe, M., Clevers, H. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.
Nature 494: 247-250 (2013)

39) Sato, T., Clevers, H., Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cells: mechanism and applications. Review
Science 340: 1190-1194 (2013)

40) Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment.
Cell 154: 274-284 (2013)

41) Stange, D.E., Koo, B.K., Huch, M., Sibbel, G., Basak, O., Lyubimova, A.,Kujalla, P., Bartfeld, S., Koster, J., Geahlen, J.H., Peters, P.J., van Es, J., van de Wetering, M., Mills, J.C., Clevers, H. Differentiated Troy+ chief cells act as ‘reserve’ stem cells to generate all lineages of stomach epithelium.
Cell 155: 357-368 (2013)

42) Schwank, G., Koo, B.K., Sasselli, V., Dekkers, J.F., Heo, I., Demircan, T., Sasaki, N., Boymans, S., Cuppen, E., van der Ent, C.K., Nieuwenhuis, E.E., Beekman, J.M. and Clevers, H. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.
Cell Stem Cell 13: 653-658 (2013)

43) Ritsma, L., Ellenbroek, S.I., Zomer, A., Snippert, H.J., de Sauvage, F.J., Simons, B.D., Clevers, H., van Rheenen, J.. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo imaging.
Nature 507: 362-5 (2014)

44) Karthaus, W.R., Iaquinta, P.J., Drost, J., Gracanin, A.., van Boxtel, R., Wongvipat, J., Dowling, C.M., Gao, D., Begthel, H., Sachs, N., Vries, R.G., Cuppen, E., Chen, Y., Sawyers, C.L., Clevers, H.C. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures.
Cell 159: 163-75 (2014).

45) Huch, M., Gehart, H., van Boxtel, R., Hamer, K., Blokzijl, F., Verstegen, M.A., Ellis, E., van Wenum, M., Fuchs, S., de Ligt, S., van de Wetering, M., Sasaki, N., Boers, S.J., Kemperman, H., de Jonge, J., Ijzermans, J.N.M., Niewenhuis, E.E.S., Hoekstra, R., Strom, S., Vries, R.G.J., van der Laan, L.J.W., Cuppen, E., Clevers, H. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver
Cell 160: 299-312 (2015)

46) Boj, S.F., Hwang, C.I., Baker, L.A., Chio, I.I., Engle, D.D., Corbo, V., Jager, M., Ponz-Sarvise, M., Tiriac, H., Spector, M.S., Gracanin, A., Oni, T., Yu, K.H., van Boxtel, R., Huch, M., Rivera, K.D., Wilson, J.P., Feigin, M.E., Öhlund, D., Handly-Santana, A., Ardito-Abraham, C.M., Ludwig, M., Elyada, E., Alagesan, B., Biffi, G., Yordanov, G.N., Delcuze, B., Creighton, B., Wright, K., Park, Y., Morsink, F.H., Molenaar, I.Q., Borel Rinkes, I.H., Cuppen, E., Hao, Y., Jin, Y., Nijman, I.J., Iacobuzio-Donahue, C., Leach, S.D., Pappin, D.J., Hammell, M., Klimstra, D.S., Basturk, O., Hruban RH, Offerhaus GJ, Vries RG, Clevers H, Tuveson DA. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.
Cell 160: 324-338 (2015)

47) van de Wetering, M., Francies, H.E., Francis, J.M., Bounova, G., Iorio, F., Pronk, A., van Houdt, W., van Gorp, J., Taylor-Weiner, A., Kester, L., McLaren-Douglas, A., Blokker, J., Jaksani, S., Bartfeld, S., Volckman, R., van Sluis, P., Li, V.S.W., Seepo, S., Sekhar Pedamallu, C., Cibulskis, C., Carter, S.L., McKenna, A., Lawrence, M.S., Lichtenstein, L., Stewart, C., Koster, J., Versteeg, R., van Oudenaarden, A., Saez-Rodriguez, J., Vries, R.G.J., Getz, G., Wessels, L., Stratton, M.R., McDermott, U., Meyerson, M., Garnett, M.J., Clevers, H. Prospective derivation of a ‘Living Organoid Biobank’ of colorectal cancer patients.
Cell 161: 933-945 (2015)

48) Drost, J, van Jaarsveld, R.H., Ponsioen, B., Zimberlin, C., van Boxtel, R., Buijs, A.,Sachs, N., Overmeer, R.M., Offerhaus, G.J., Begthel, H. Korving, J., van de Wetering, M., Schwank, G. Logtenberg, M., Cuppen, E., Snippert, H.J., Medema, J.P., Kops, G. J. P. L., Clevers, H. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells.
Nature 521: 43-47 (2015)