Genfunctie onderzoeken: een handleiding

Alle organismen – van bacteriën tot planten en dieren – bezitten een groot aantal genen in hun DNA die samen de opmaak van het organisme bepalen: hoe het zich ontwikkelt, de kleur van de ogen of bladeren enzovoorts. Biologen onderzoeken al geruime tijd de functies van al deze individuele genen om inzicht te krijgen in hoe organismen werken en zich ontwikkelen, hoe genetische aandoeningen ontstaan en hoe deze kunnen worden behandeld. Een van de organismen die een rol speelt in zulk fundamenteel biologisch onderzoek is de zebravis, een kleine tropische vis die wordt gebruikt als model voor de ontwikkeling van wervels.

Genen in het DNA kunnen gezien worden als de masterhandleiding voor het maken van eiwitten. Omdat het belangrijk is dat deze instructies niet verloren gaan worden er kleine kopieën van de genen gemaakt in een molecuul genaamd RNA. Het RNA is als een geprinte kopie van de originele handleiding, het DNA. Deze kopie wordt in de cel gebruikt als instructie om eiwitten te maken, net zoals je een IKEA-handleiding gebruikt om een kast in elkaar te zetten.

Knock-down en knock-out

Er zijn meerdere manieren om genfunctie te onderzoeken. In het lab kun je een gen van een zebravis bijvoorbeeld op verschillende manieren aan- en uitzetten en de effecten vergelijken met een zebravis met normale genfunctie – ook wel het wildtype genoemd. Een van de manieren waarop je een gen kunt uitzetten is door het RNA te blokkeren – hierdoor zijn de zogenoemde geprinte kopieen van de handleiding niet beschikbaar en kunnen er geen eiwitten worden gebouwd. Dat is alsof je alle handleidingen voor het in elkaar zetten van een bepaalde kast onderschept zodat niemand de kast meer kan bouwen. Deze methode heet ‘knock-down’ en maakt gebruik van een morpholino, een klein molecuul dat het RNA-molecuul blokkeert in het maken van eiwitten. Een andere manier waarop genfunctie geblokkeerd kan worden is door het creëren van een mutatie in het DNA, waardoor het gen in het DNA zelf wordt uitgezet – deze methode wordt ook wel ‘knock-out’ genoemd. In de eerder gebruikte analogie betekent dit het aanpassen of zelfs verwijderen van de originele handleiding in de database van IKEA, zodat er geen kopieën (RNA-moleculen) meer van kunnen worden gemaakt en er geen kasten (eiwitten) kunnen worden gebouwd.

Het gebruik van de knock-down aanpak met bijvoorbeeld een morpholino wordt veel gebruikt om genfunctie te onderzoeken in organismes zoals zebravissen. De techniek werkt snel en morpholinos zijn van tijdelijke aard: geprinte kopieën zijn weer beschikbaar zodra de morpoholino is verwijderd. Veranderingen aanbrengen in het DNA door middel van knock-out (in plaats van knock-down) methodes is ingewikkelder. Het zorgt ervoor dat er überhaupt geen geprinte kopie (RNA) meer van de handleiding (DNA) wordt gemaakt.

Variërende resultaten

De resultaten van knock-down and knock-out studies komen niet altijd overeen, waardoor er onzekerheid kan ontstaan over welke resultaten juist zijn. In samenwerking met de groepen van Gage Crump (University of South Carolina) en Jamie Nichols (University of Colorado), beschrijven onderzoekers van de groep van Jeroen Bakkers daarom een grondige manier om de verschillen tussen resultaten van knock-down en knock-out studies te benaderen. Ze vonden een studie die beschrijft hoe het gen prrx1a betrokken is bij de juiste ontwikkeling van het hart. De studie gebruikte een morpholino om de functie van prrx1a te onderdrukken – een knock-down model, wat resulteerde in het ontstaan van fouten in de ontwikkeling van het hart. De studie concludeerde daarom dat prrx1a een belangrijke rol speelt in de vorming van het hart. Echter, een andere studie maakte gebruik van een knock-out voor het prrx1a-gen vond geen afwijkingen in de ontwikkeling van het hart. Tegenstrijdige resultaten dus: de nieuwsgierigheid van de onderzoekers van Bakkers’ groep was gewekt.

Compensatie

De complexiteit van knock-out studies werd recentelijk nog groter met de beschrijving van zogenoemde ‘transcriptie adaptatie’. Om een gen uit te schakelen, worden vaak fouten toegevoegd aan de sequentie van een gen zodat het eiwit dat gemaakt wordt niet goed functioneert. Het organisme detecteert dit en reguleert vervolgens de activiteit van gerelateerde genen om deze ‘foute’ eiwitten te compenseren. Om de eerdergenoemde analogie te gebruiken: de handleiding voor het in elkaar zetten van de ene kast is incorrect of incompleet, dus de handleiding van de andere kast wordt gebruikt om de bouw toch af te ronden. Dit mechanisme kan omzeild worden als de geprinte kopieen volledig afwezig zijn, bijvoorbeeld door het gebruik van een morpholino of door te voorkomen dat er RNA wordt gemaakt. De laatstgenoemde techniek werd ook door de onderzoekers van het Hubrecht Instituut toegepast. Ze gebruikten zebravissen en maakten het op verschillende manieren onmogelijk voor het prrx1a gen om RNA te produceren. Dit leidde niet tot fouten in de ontwikkeling van het hart.

Belang van validatie

Ook gebruikten de onderzoekers een morpholino voor het prrx1a gen in zebravissen die al een knock-out voor ditzelfde gen hadden. Deze zebravissen maken van zichzelf al geen RNA van het prrx1a gen: een morpholino die het RNA-molecuul onderschept zou dus geen effect moeten hebben. Echter, tegen de verwachting in zagen de onderzoekers dat het gebruik van de morpholino leidde tot fouten in de ontwikkeling van het hart. Met andere woorden, de onderzoekers toonden aan dat de fouten in dit proces worden veroorzaakt door de aanwezigheid van de morpholino en niet door de specifieke remming van de functie van het prrx1a gen.

Met deze studie laten de onderzoekers zien dat het bestuderen van genfunctie nauwkeurig gedaan moet worden – zeker als er remmers zoals morpholinos worden gebruikt om RNA-moleculen te onderscheppen. Resultaten van zulke studies moeten altijd op verschillende manieren gevalideerd worden om aan te kunnen tonen dat de gevonden resultaten niet zijn veroorzaakt door gebruikte methode.

~~~

Publicatie

Zebrafish prrx1a mutants have normal hearts. Federico Tessadori, Dennis E. M. de Bakker, Lindsey Barske, Nellie Nelson, Hermine A. Algra, Sven Willekers, James T. Nichols, J. Gage Crump en Jeroen Bakkers. Nature 2020.

Banner afbeelding: in rood de trilharen in een orgaan dat de Kupffer’s vesicle heet in het zebravissenembryo. Deze trilharen zijn betrokken bij het bepalen van de asymmetrie in het lichaam van de zebravis, waaronder de asymmetrie in het hart zoals te zien is in de andere afbeelding op deze pagina. Beeld: Sven Willekers